1ª PRÁCTICA
26/11/19
PRÁCTICA Nº1: "ESTREPTOLISINA O LIOFILIZADA"
DETERMINACIÓN DEL TITULO DE ANTI-SLO
Para diagnóstico "in vitro"
INTRODUCCIÓN
La Estreptolisina O (SLO) liofilizada, es un purificado procedente del cultivo de Estreptococos Beta-hemolíticos. Se trata de un producto estandarizado para la determinación cuantitativa del título de antiestreptolisina O, por la técnica de inhibición de la hemólisis.
PRINCIPIO DEL MÉTODO
El carácter inmunogénico de la SLO permite valorar la extensión de una infección estreptocócica, por simple titulación del nivel en suero de anticuerpos anti-SLO. Diluciones crecientes del suero problema se enfrentan con una cantidad constante de SLO, en presencia de una suspensión de hematíes, determinándose la dilución de suero más alta capaz de inhibir el poder hemolítico de la toxina. La inversa de dicha dilución corresponde al título del suero.
SIGNIFICACO CLÍNICO
Streptococcus pyogenes (estreptococo del grupo A, Beta hemolítico) es la causa bacteriana más frecuente de faringitis aguda y también origina distintas infecciones cutáneas y sistémicas. La Infección puede acarrear dos secuelas: fiebre reumática aguda y glomerulonefritis aguda postestreptocócica.
La mayor parte de las cepas de estreptococos del grupo A también elabora una hemolisinas, la estreptolisina O provoca hemólisis de los hematíes.
La estreptolisina O tiene carácter antigénico y en la clínica, la técnica serológica más utilizada para detectar la infección estreptocócica del grupo A, es la titulación de los anticuerpos antiestreptolisina O (ASO) en el suero del ser humano.
REACTIVOS
Rehidratar el vial de Estreptolisina O liofilizada con 15 mL de agua destilada.
Mezclar suavemente evitando los movimiento enérgicos que podrían conducir a la oxidación del producto. El olor característico de la disolución es debido a la presencia de un reductor. Se recomienda proceder a la hidratación del vial justo antes de la determinación.
CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD
El producto liofilizado guardado en refrigerador a 2º-8ºC es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. El vial reconstruído, es estable 1 hora a temperatura ambiente y 3 horas en refrigerador a 2º-8ºC.
MUESTRA
MICROMÉTODO
Antes de proceder a la realización de la práctica, debemos preparar una serie de disoluciones:
- Suspensión de hematíes al 3%: 3 ml de suspensión de hematíes + 97 mL de tampón fosfato pH 6,5.
- Diluciones del suero.
- 1 x 100 ml Tampón fosfato isotónico pH 6,5.
10 veces concentrado. Diluir con agua desionizada hasta obtener 1 litro de disolución.
NOTA: Todo ello,ha sido preparado por los alumnos de la 1ª mesa del laboratorio y posteriormente alicuotado en tubos eppendorf y tubos de ensayo (solución tampón) para las demás mesas.
A continuación, una vez preparado las disoluciones necesarias en esta práctica, proceder del siguiente modo:
El título de antiestreptolisina O corresponde a la inversa de la mayor dilución de suero en cuyo pocillo no se detecta hemólisis en el sobrenadante.
Controles.
- Hematíes: El sobrenadante debe aparecer claro (libre de hemólisis).
- Estreptolisina O: El sobrenadante debe presentar una hemólisis evidente.
RESULTADOS
A pesar de que no se puede apreciar muy bien debido al reflejo de la luz, el título de la fila A ha sido 80 (pocillo nº3), y el título resultante de la fila B ha sido 200 (pocillo nº3).
VALORES NORMALES
Hasta 166-250 unidades Todd.
LIMITACIONES DEL MÉTODO
En algunos casos aislados puede ocurrir que, aun en la evidencia de una infección estreptocócica, los resultados del test den valores inferiores a los esperados. En este caso, se recomienda efectuar otras pruebas para patentizar los anticuerpos frente a otras proteínas del mismo microorganismo.
Sueros con un alto contenido en Beta-lipoproteínas, así como muestras contaminadas, pueden dar lugar a valores anormalmente elevados del título de anti-SLO.
OBSERVACIONES
PRÁCTICA Nº1: "ESTREPTOLISINA O LIOFILIZADA"
DETERMINACIÓN DEL TITULO DE ANTI-SLO
Para diagnóstico "in vitro"
INTRODUCCIÓN
La Estreptolisina O (SLO) liofilizada, es un purificado procedente del cultivo de Estreptococos Beta-hemolíticos. Se trata de un producto estandarizado para la determinación cuantitativa del título de antiestreptolisina O, por la técnica de inhibición de la hemólisis.
PRINCIPIO DEL MÉTODO
El carácter inmunogénico de la SLO permite valorar la extensión de una infección estreptocócica, por simple titulación del nivel en suero de anticuerpos anti-SLO. Diluciones crecientes del suero problema se enfrentan con una cantidad constante de SLO, en presencia de una suspensión de hematíes, determinándose la dilución de suero más alta capaz de inhibir el poder hemolítico de la toxina. La inversa de dicha dilución corresponde al título del suero.
SIGNIFICACO CLÍNICO
Streptococcus pyogenes (estreptococo del grupo A, Beta hemolítico) es la causa bacteriana más frecuente de faringitis aguda y también origina distintas infecciones cutáneas y sistémicas. La Infección puede acarrear dos secuelas: fiebre reumática aguda y glomerulonefritis aguda postestreptocócica.
La mayor parte de las cepas de estreptococos del grupo A también elabora una hemolisinas, la estreptolisina O provoca hemólisis de los hematíes.
La estreptolisina O tiene carácter antigénico y en la clínica, la técnica serológica más utilizada para detectar la infección estreptocócica del grupo A, es la titulación de los anticuerpos antiestreptolisina O (ASO) en el suero del ser humano.
REACTIVOS
- Estreptolisina O liofilizada.
- Tampón fosfato pH 6,5.
- Suero diluido al 1/10 y al 1/25.
- Reagent Red Blood Cells: 3 mL, 2-4%. Suspensión de hematíes al 3%.
- Gradilla.
- Pipeta automática de 10-100 microlitros.
- Puntas amarillas de pipeta.
- Papel Parafilm.
- Envase desechable ("contenedor de desechos").
- Placa Microtiter con fondo en "U".
Rehidratar el vial de Estreptolisina O liofilizada con 15 mL de agua destilada.
Mezclar suavemente evitando los movimiento enérgicos que podrían conducir a la oxidación del producto. El olor característico de la disolución es debido a la presencia de un reductor. Se recomienda proceder a la hidratación del vial justo antes de la determinación.
CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD
El producto liofilizado guardado en refrigerador a 2º-8ºC es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. El vial reconstruído, es estable 1 hora a temperatura ambiente y 3 horas en refrigerador a 2º-8ºC.
MUESTRA
- Suero fresco diluido al 1/10 y al 1/25.
Mantener en refrigerador a 2º-8ºC, no más de 5 días.
MICROMÉTODO
Antes de proceder a la realización de la práctica, debemos preparar una serie de disoluciones:
- Suspensión de hematíes al 3%: 3 ml de suspensión de hematíes + 97 mL de tampón fosfato pH 6,5.
- Diluciones del suero.
- Suero 1/10: 0'2 ml de suero + 1'8 ml de tampón.
- Suero 1/25: 0'1 ml de suero + 2'4 ml de tampón.
- 1 x 100 ml Tampón fosfato isotónico pH 6,5.
10 veces concentrado. Diluir con agua desionizada hasta obtener 1 litro de disolución.
NOTA: Todo ello,ha sido preparado por los alumnos de la 1ª mesa del laboratorio y posteriormente alicuotado en tubos eppendorf y tubos de ensayo (solución tampón) para las demás mesas.
A continuación, una vez preparado las disoluciones necesarias en esta práctica, proceder del siguiente modo:
- En primer lugar, hemos depositado 50 microlitros de la "solución tampón" en cada pocillo de las filas A y B de la placa microtiter con ayuda de la pipeta automática ajustada a 50 microlitros y puntas amarillas.
Nota: En cada fila, hemos puesto 50 microlitros de solución tampón hasta el pocillo nº 10.
- Posteriormente, echar 50 microlitros del suero diluido al 1/10, en el pocillo nº1 de la fila A. Mezclar la disolución de solución tampón + suero 1/10 por pipeteo y traspasar 50 microlitros del pocillo nº1 al pocillo nº2. Desechar la punta de pipeta y volver a mezclar la disolución contenida en el pocillo nº2; una vez homogeneizada, traspasar otros 50 microlitros del pocillo nº2 al pocillo nº3.
Este proceso se repite hasta el pocillo nº 9 de la fila A, donde homogeneizaremos y desecharemos los 50 microlitros sobrantes al contenedor de desechos. - Depositar 50 microlitros del suero 1/25 en el pocillo nº1 de la fila B. Homogeneizar y traspasar 50 microlitros de éste al pocillo nº2 (al igual que con el suero 1/10 de la fila A).
Este proceso se repite hasta el pocillo nº9 de la fila B, donde homogeneizaremos y desecharemos los 50 microlitros sobrantes al contenedor de desechos, dejando el último pocillo de las filas A y B libres de suero para control. - A continuación, depositar 25 microlitros de disolución de estreptolisina O rehidratada a cada uno de los 10 pocillos de las filas A y B, excepto en el pocillo nº10 de la fila B (el último pocillo).
- Agitar suavemente la placa microtiter dándole pequeños golpecitos sobre la mesa y taparla con papel Parafilm.
- Introducir la placa en la estufa a 37ºC durante 15 minutos.
- Añadir 25 microlitros de suspensión de hematíes al 3% a cada uno de los 10 pocillos de las filas A y B.
- Agitar suavemente la placa microtiter del mismo modo que en el caso anterior e incubar en estufa la placa durante 45 minutos a 37ºC, agitando después de los primeros 15 minutos.
- Dejar sedimentar durante unos 50-60 minutos a temperatura ambiente.
El título de antiestreptolisina O corresponde a la inversa de la mayor dilución de suero en cuyo pocillo no se detecta hemólisis en el sobrenadante.
Controles.
- Hematíes: El sobrenadante debe aparecer claro (libre de hemólisis).
- Estreptolisina O: El sobrenadante debe presentar una hemólisis evidente.
RESULTADOS
A pesar de que no se puede apreciar muy bien debido al reflejo de la luz, el título de la fila A ha sido 80 (pocillo nº3), y el título resultante de la fila B ha sido 200 (pocillo nº3).
VALORES NORMALES
Hasta 166-250 unidades Todd.
LIMITACIONES DEL MÉTODO
En algunos casos aislados puede ocurrir que, aun en la evidencia de una infección estreptocócica, los resultados del test den valores inferiores a los esperados. En este caso, se recomienda efectuar otras pruebas para patentizar los anticuerpos frente a otras proteínas del mismo microorganismo.
Sueros con un alto contenido en Beta-lipoproteínas, así como muestras contaminadas, pueden dar lugar a valores anormalmente elevados del título de anti-SLO.
OBSERVACIONES
- A la hora de depositar los hematíes (25 microlitros en cada pocillo de las filas A y B) NO resuspender.
- Utilizar una punta de pipeta distinta al efectuar las sucesivas diluciones de los sueros 1/10 y 1/25 en las filas A y B, respectivamente.
- En esta práctica, sólo hemos realizado el MICROMETODO, el MACROMETODO no.
- Las diluciones obtenidas en las filas A y B serían las siguientes:
- Fila A: 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320, 1/640, 1/1280, 1/2560, 1/5120, Control SLO.
- Fila B: 1/50, 1/100, 1/200, 1/400, 1/800, 1/1600, 1/3200, 1/6400, 1/12800, Control Hematíes.
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