2ª PRÁCTICA
10/12/19
PRÁCTICA Nº 2: "INTERACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO"
"EL PROCEDIMIENTO OUCHTERLONY"
OBJETIVO
Las interacciones de un anticuerpo (Ab) con un antígeno (Ag) es la reacción fundamental de la inmunología.
Ab + Ag --> Ab-Ag.
La mayoría de los antígenos son proteínas. La identidad exacta de los grupos que reaccionan con el anticuerpo generalmente no se conoce. Los antígenos macromoleculares y los anticuerpos forman complejos que se vuelven insolubles y precipitan. Esta propiedad hace posible realizar ensayos cualitativos y cuantitativos en el sistema anticuerpo-antígeno.
La precipitación ocurre con la mayoría de los antígenos debido a que el antígeno es multivalente, es decir, tiene varios determinantes antigénicos por molécula a los que se pueden unir los anticuerpos. Los anticuerpos tienen al menos dos sitios de unión a antígeno, por lo que se forman grandes agregados o retículos de antígeno y anticuerpo. Experimentalmente, se agrega una cantidad creciente de antígeno a una cantidad constante de anticuerpo en solución. Inicialmente a baja concentración de antígeno, todo el antígeno está contenido en el precipitado. Esto se llama zona de exceso de anticuerpos. A medida que se agrega más antígeno, la cantidad de proteína precipitada aumenta hasta que las moléculas de antígeno y anticuerpo están en una proporción óptima. Esto se llama zona de equivalencia, o punto de equivalencia, donde ocurre la precipitación máxima. Cuando la cantidad de antígeno en solución excede la cantidad de anticuerpo, la cantidad de precipitación disminuirá. Esto se conoce como la zona de exceso de antígeno.
Cuando los anticuerpos y antígenos se insertan en diferentes áreas de un gel de agarosa, se difunden uno hacia el otro y forman bandas opacas de precipitado en la interfaz de sus frentes de difusión. Las reacciones de precipitación de anticuerpos y antígenos en geles de agarosa proporcionan un método para analizar diversas reacciones anticuerpo-antígeno.
EL PROCEDIMIENTO DE OUCHTERLONY
La doble difusión en dos dimensiones es un procedimiento simple inventado por el científico sueco Örjan Ouchterlony. Las soluciones de antígeno y anticuerpo se colocan en pocillos separados cortados en una placa de agarosa. Los reactivos se difunden desde los pozos uno hacia el otro y precipitan donde se encuentran en proporciones equivalentes. Un único antígeno se combinará con su anticuerpo homólogo para formar una única línea de precipitación. Cuando dos antígenos están presentes, cada uno se comporta independientemente el uno del otro. Por lo tanto, el número de bandas de precipitación indica que hay al menos muchos pares de anticuerpos y antígenos presentes.Las flechas indican patrones de difusión de antígenos y anticuerpos.
La doble difusión en dos dimensiones es una técnica útil para comparar antígenos para el número de determinantes idénticos o de reacción cruzada. Si se coloca una solución de antígeno en dos pocillos adyacentes y el anticuerpo homólogo se coloca bien en el centro, las dos bandas de precipitación que se forman se unirán en sus extremos más cercanos y se fusionarán. Esto se conoce como una reacción de identidad.
Cuando se colocan antígenos no relacionados en pocillos adyacentes y el pocillo central se llena con anticuerpos para cada antígeno, las bandas de precipitación se formarán independientemente entre sí y se cruzarán. Esto se conoce como una reacción de no identidad.
Si dos antígenos purificados reaccionan de forma cruzada, colocándolos en pocillos periféricos adyacentes con anticuerpos contra uno en el pocillo central se obtendrá una banda única con el antígeno homólogo y de reacción cruzada. Como el antígeno de reacción cruzada carece de algunos de los determinantes antigénicos presentes en el antígeno homólogo, no puede precipitar todo el anticuerpo. El anticuerpo restante se difundirá más allá de la línea del precipitado de reacción cruzada para reaccionar con el antígeno homólogo para producir un espolón. El espolón forma proyecciones hacia el antígeno con menos determinantes, es decir, el antígeno de reacción cruzada. Esto se llama reacción de identidad parcial.
Dado que estos anticuerpos que no provocan una reacción cruzada a menudo son solo una fracción del anticuerpo total implicado en la reacción de precipitación homóloga, el espolón suele ser menos denso (a menudo difícil de visualizar) que la banda de precipitación desde la que se proyecta.
PROCEDIMIENTO
1º) PREPARACIÓN DE AGAROSA
- Pocillo central: antisuero contra el líquido que contiene anticuerpos (tubo A).
- Pocillo superior izquierdo: suero entero (tubo B).
- Pocillo superior derecho: suero entero (tubo B).
- Pocillo inferior izquierdo: suero entero (tubo B).
- Pocillo inferior derecha: suero entero (tubo B).
Placa 2 (De esta placa me he encargado yo).
- Pocillo central: antisuero contra el líquido que contiene anticuerpos (tubo A).
- Pocillo superior izquierdo: suero entero (tubo B).
- Pocillo superior derecho: albúmina (tubo C).
- Pocillo inferior izquierdo: albúmina (tubo C).
- Pocillo inferior derecha: suero entero (tubo B).
Placa 3 (De esta placa se ha encargado María del Mar).
- Pocillo central: antisuero contra el líquido que contiene anticuerpos (tubo A).
- Pocillo superior izquierdo: IgG (tubo D).
- Pocillo superior derecho: albúmina (tubo C).
- Pocillo inferior izquierdo: albúmina (tubo C).
- Pocillo inferior derecho: IgG (tubo D).
5º) INCUBACIÓN
Colocar las tapas en las placas. Colocar con cuidado las placas cubiertas en la cámara de incubación sobre una capa de toallas de papel húmedas. No invertir las placas. Cubrir la cámara con una envoltura de plástico y dejar incubar a temperatura ambiente entre 24 y 48 horas para permitir que se formen líneas de precipitación.
12/12/19
Hemos procedido a realizar la lectura de las placas pero hemos tenido que dejarlas incubar un poco más de tiempo porque no han migrado del todo.
17/12/19
LECTURA DE RESULTADOS
PRÁCTICA Nº 2: "INTERACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO"
"EL PROCEDIMIENTO OUCHTERLONY"
OBJETIVO
- Introducir los principios de las interacciones antígeno-anticuerpo usando el procedimiento Ouchterlony.
- Antisuero (Anticuerpo): 4-8ºC.
- Suero total (Antígeno): 4-8ºC.
- Albúmina (Antígeno): 4-8ºC.
- IgG (Antígeno): 4-8ºC.
- Tampón en polvo: Tª ambiente.
- 1 Agarosa UltraSpec: Tª ambiente.
- 1 tubo de solución de carga para practicar: Tª ambiente.
- 40 Tubos Microtest.
- 40 Pipetas de transferencia.
- 1 Plantilla para corte de pocillos (en el protocolo).
- 10 Cortadores para pocillos ("well cutters").
- 40 Placas de Petri.
NOTA: Tras la recepción, almacenar los componentes a las temperaturas indicadas.
NOTA: Ninguno de los componentes de este kit se ha preparado a partir de material humano.
NOTA: Todos los componentes de este kit están destinados a la investigación educativa. No pueden ser utilizados con fines de diagnóstico o médicos, ni pueden ser administrados o consumidos por seres humanos o animales.
- 3 Envase de plástico o placa Pyrex.
- Baño de agua o baño María.
- 2 Pipetas automáticas de: 10-100 microlitros (puntas amarillas) y otra de 1000-5000 microlitros (puntas de pipeta para 5000 microlitros).
- Espátula o mondadientes.
- Gradilla para colocar los tubos eppendorf.
- Pipetas Pasteur.
- Tijeras.
- Agua destilada.
- Aguja con dispositivo de seguridad.
- Rotulador.
- Microondas.
- Probeta de 250 mL.
- Vaso de precipitados de 600 mL.
- Contador de colonias para visualizar los resultados en las placas.
Nota: Asegúrense que el material de vidrio esté limpio, seco y libre de residuos de jabón. Para mayor comodidad, se pueden comprar pipetas de transferencia desechables adicionales.
Las interacciones de un anticuerpo (Ab) con un antígeno (Ag) es la reacción fundamental de la inmunología.
Ab + Ag --> Ab-Ag.
La mayoría de los antígenos son proteínas. La identidad exacta de los grupos que reaccionan con el anticuerpo generalmente no se conoce. Los antígenos macromoleculares y los anticuerpos forman complejos que se vuelven insolubles y precipitan. Esta propiedad hace posible realizar ensayos cualitativos y cuantitativos en el sistema anticuerpo-antígeno.
La precipitación ocurre con la mayoría de los antígenos debido a que el antígeno es multivalente, es decir, tiene varios determinantes antigénicos por molécula a los que se pueden unir los anticuerpos. Los anticuerpos tienen al menos dos sitios de unión a antígeno, por lo que se forman grandes agregados o retículos de antígeno y anticuerpo. Experimentalmente, se agrega una cantidad creciente de antígeno a una cantidad constante de anticuerpo en solución. Inicialmente a baja concentración de antígeno, todo el antígeno está contenido en el precipitado. Esto se llama zona de exceso de anticuerpos. A medida que se agrega más antígeno, la cantidad de proteína precipitada aumenta hasta que las moléculas de antígeno y anticuerpo están en una proporción óptima. Esto se llama zona de equivalencia, o punto de equivalencia, donde ocurre la precipitación máxima. Cuando la cantidad de antígeno en solución excede la cantidad de anticuerpo, la cantidad de precipitación disminuirá. Esto se conoce como la zona de exceso de antígeno.
Cuando los anticuerpos y antígenos se insertan en diferentes áreas de un gel de agarosa, se difunden uno hacia el otro y forman bandas opacas de precipitado en la interfaz de sus frentes de difusión. Las reacciones de precipitación de anticuerpos y antígenos en geles de agarosa proporcionan un método para analizar diversas reacciones anticuerpo-antígeno.
EL PROCEDIMIENTO DE OUCHTERLONY
La doble difusión en dos dimensiones es un procedimiento simple inventado por el científico sueco Örjan Ouchterlony. Las soluciones de antígeno y anticuerpo se colocan en pocillos separados cortados en una placa de agarosa. Los reactivos se difunden desde los pozos uno hacia el otro y precipitan donde se encuentran en proporciones equivalentes. Un único antígeno se combinará con su anticuerpo homólogo para formar una única línea de precipitación. Cuando dos antígenos están presentes, cada uno se comporta independientemente el uno del otro. Por lo tanto, el número de bandas de precipitación indica que hay al menos muchos pares de anticuerpos y antígenos presentes.Las flechas indican patrones de difusión de antígenos y anticuerpos.
La doble difusión en dos dimensiones es una técnica útil para comparar antígenos para el número de determinantes idénticos o de reacción cruzada. Si se coloca una solución de antígeno en dos pocillos adyacentes y el anticuerpo homólogo se coloca bien en el centro, las dos bandas de precipitación que se forman se unirán en sus extremos más cercanos y se fusionarán. Esto se conoce como una reacción de identidad.
Cuando se colocan antígenos no relacionados en pocillos adyacentes y el pocillo central se llena con anticuerpos para cada antígeno, las bandas de precipitación se formarán independientemente entre sí y se cruzarán. Esto se conoce como una reacción de no identidad.
Si dos antígenos purificados reaccionan de forma cruzada, colocándolos en pocillos periféricos adyacentes con anticuerpos contra uno en el pocillo central se obtendrá una banda única con el antígeno homólogo y de reacción cruzada. Como el antígeno de reacción cruzada carece de algunos de los determinantes antigénicos presentes en el antígeno homólogo, no puede precipitar todo el anticuerpo. El anticuerpo restante se difundirá más allá de la línea del precipitado de reacción cruzada para reaccionar con el antígeno homólogo para producir un espolón. El espolón forma proyecciones hacia el antígeno con menos determinantes, es decir, el antígeno de reacción cruzada. Esto se llama reacción de identidad parcial.
PROCEDIMIENTO
1º) PREPARACIÓN DE AGAROSA
- En un vaso de precipitados de 600 mL, agregar todo el contenido del paquete de tampón en polvo (componente E) a 225 mL de agua destilada. Agitar la disolución con una varilla de vidrio para disolver totalmente el polvo.
Nota: Para medir los 225 mL de agua destilada, hemos utilizado una probeta de 250 mL, de manera que cuando casi lleguemos a la línea del volumen deseado de agua, enrasar con pipeta Pasteur.
- Añadir todo el contenido del paquete de Agarosa UltraSpec (3g) al vaso de precipitados. Agitar la suspensión para dispersar los grumos.
- Se debe calentar (hasta punto de ebullición) la solución para disolver la agarosa. Para ello, introducir el vaso de precipitados en el microondas a temperatura alta en 30 segundos. Mantener la mezcla en el microondas hasta que toda la agarosa gelatinosa se disuelva. Verificar que no haya pequeñas partículas claras de agarosa. La solución final debe ser clara y transparente.
- Enfriar la solución de agarosa a 55ºC en el baño María. Agitar el vaso de precipitados en el baño para facilitar la disipación del calor.
- Preparar alícuotas de 25 mL de la solución de agarosa (55ºC) para cada uno de los grupos de alumnos.
- Usar una pipeta de 1000-5000 microlitros para pipetear cuidadosamente 5 mL de la agarosa líquida (enfriada a 55ºC) en cada placa, moviendo la placa circularmente para cubrir el fondo con agarosa.
Nota 1: En la clase somos 7 grupos de 3 personas, y cada componente del grupo, hará una placa.
Nota 2: Si la agarosa líquida contiene burbujas, agitar suavemente la placa para eliminarlas. - Dejar que la agarosa se solidifique. Esto tardará 10-15 minutos, en cuyo momento el gel aparecerá un poco opaco.
- Disponer de varias copias de la plantilla (3 copias) para cada grupo.
- Colocar la plantilla debajo de una de las placas para que el patrón esté en el centro de la placa. Las distancias entre los pocillos son importantes. Intentar seguir la plantilla con la mayor precisión posible.
- Para realizar los pocillos, cortar la parte inferior de pipetas Pasteur. Mantener pulsada la boquilla de la parte superior de la pipeta, hincar la pipeta en el gel de agarosa en uno de los pocillos (según la plantilla) y soltar la boquilla. De esta manera, el tapón de agarosa será succionado por la pipeta. Nota: En caso de que el tapón de agarosa que deseamos retirar queda adherido al gel de agarosa aún, nos ayudaremos de una aguja para quitarlo del gel completamente.
- Repetir este procedimiento para los demás pocillos de las placas.
- Llenar los pocillos centrales de las tres placas con 30 microlitros de antisuero (anticuerpo) del tubo A. Los pocillos deben aparecer llenos, pero tener cuidado de no llenar demasiado los pocillos.
- Llenar los pocillos externos con 30 microlitros de antígeno usando una punta de pipeta limpia para cada antígeno de la siguiente manera:
- Pocillo central: antisuero contra el líquido que contiene anticuerpos (tubo A).
- Pocillo superior izquierdo: suero entero (tubo B).
- Pocillo superior derecho: suero entero (tubo B).
- Pocillo inferior izquierdo: suero entero (tubo B).
- Pocillo inferior derecha: suero entero (tubo B).
Placa 2 (De esta placa me he encargado yo).
- Pocillo central: antisuero contra el líquido que contiene anticuerpos (tubo A).
- Pocillo superior izquierdo: suero entero (tubo B).
- Pocillo superior derecho: albúmina (tubo C).
- Pocillo inferior izquierdo: albúmina (tubo C).
- Pocillo inferior derecha: suero entero (tubo B).
Placa 3 (De esta placa se ha encargado María del Mar).
- Pocillo central: antisuero contra el líquido que contiene anticuerpos (tubo A).
- Pocillo superior izquierdo: IgG (tubo D).
- Pocillo superior derecho: albúmina (tubo C).
- Pocillo inferior izquierdo: albúmina (tubo C).
- Pocillo inferior derecho: IgG (tubo D).
5º) INCUBACIÓN
Colocar las tapas en las placas. Colocar con cuidado las placas cubiertas en la cámara de incubación sobre una capa de toallas de papel húmedas. No invertir las placas. Cubrir la cámara con una envoltura de plástico y dejar incubar a temperatura ambiente entre 24 y 48 horas para permitir que se formen líneas de precipitación.
12/12/19
Hemos procedido a realizar la lectura de las placas pero hemos tenido que dejarlas incubar un poco más de tiempo porque no han migrado del todo.
17/12/19
LECTURA DE RESULTADOS
- Situar las placas debajo de la lupa y sobre la luz de un contador de colonias para realizar la lectura de manera sencilla.
- En la placa nº1 (Reacción de identidad) se debe tener en cuenta la serie de líneas de precipitación que indican que muchos sistemas Ag-Ac pueden estar visibles.
- Placa nº2 (Reacción de identidad parcial): Los "espolones" (prolongaciones de las líneas de precipitación) pueden ser débiles. La albúmina es reconocida por el antisuero en forma purificada o como un componente del suero. El antisuero también reconoce muchos otros componentes del suero.
- Placa nº3 (Reacción de no identidad): Los "espolones" pueden ser débiles. IgG y albúmina son componentes inmunológicamente no idénticos a los del suero completo. Ambos son reconocidos por diferentes anticuerpos en el antisuero fabricado contra el suero de conejo completo.
Nota: Técnicamente, esta no es una reacción de identidad parcial. Es una reacción de no identidad, ya que la albúmina también está en el suero. El espolón son todas las otras proteínas que reaccionan con el antisuero que antigénicamente no tienen nada en común con la albúmina.
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