3ª PRÁCTICA

17/12/19
PRÁCTICA Nº3: "IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR INMUNOELECTROFORESIS"

INTRODUCCIÓN
La inmunoelectroforesis es una técnica de separación e identificación de sustancias (habitualmente proteínas) que atraviesa dos fases. Durante la primera fase, separamos las proteínas de la muestra mediante una electroforesis convencional en agarosa. En la segunda fase, se practica un carril o canal paralelo al recorrido electroforético y se rellena con un Ac antiproteína adecuado.
La difusión del Ag (proteína) y del Ac (suero antiproteína) permitirá que ambos se unan y reaccionen entre sí formando un complejo Ag-Ac que se hará visible en forma de unos arcos de precipitación.

OBJETIVO

• Separar las proteínas contenidas en un suero e identificar en él la posible presencia de Albúmina e IgG.

MATERIALES NECESARIOS

• A: Ig G
• B: Suero sanguíneo
• C: Albúmina
• D: Anticuerpos frente al suero
• E: Anticuerpo frente a la Ig G
• F: Polvo de agarosa
• G: Tampón de electroforesis concentrado (25x)
• Papel de filtro
• Invento que consiste en una placa de Petri unida a 2 portaobjetos a cada lado para perforar los canales en el agar don difundirán las muestras
• Pipetas Pasteur
• Probeta de 100 mL
• Pipeta de 10 mL y auxiliar de pipeteado verde
• Vaso de precipitados
• Matraz Erlenmeyer de 500 mL
• Pipeta automática de 20 microlitros y puntas amarillas
• Molde constituido por una placa de petri y 4 portaobjetos (2 a cada lado)

PROCEDIMIENTO
1º) PREPARACIÓN DEL TAMPÓN Y EL GEL DE ELECTROFORESIS

1. Preparar el tampón de electroforesis diluyendo el total (38 mL) del bote que lo contiene en forma concentrada (componente G) en 912 mL de agua destilada para obtener un volumen total de tampón de 950 mL. Este tampón se usará para preparar la agarosa y realizar la electroforesis.
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
2. Preparar la solución para el gel de agarosa, para ello:

a) Añadir 1 gramo de agarosa (medido en una balanza electrónica con ayuda de una espátula) en 100 mL del tampón de electroforesis obtenido en el paso anterior. Utilizar para ello un matraz Erlenmeyer de 500 mL y un embudo.

Nota: Para medir los 100 mL del tampón de electroforesis anteriores, utilizar una probeta de 100 mL y enrasar con una pipeta Pasteur. 

b) Poner un tapón de papel al matraz Erlenmeyer y calentar la mezcla en el microondas, hasta disolver el polvo de agarosa (1 minuto a máxima potencia). Al final, la solución debe ser transparente y no debe contener partículas sin disolver.

c) Enfriar la solución en el baño María hasta 55ºC.

3. Construir un molde para los carriles utilizando una placa de petri pequeña (6 cm de diámetro) y cuatro portaobjetos.
Nota: El molde ya estaba hecho en el laboratorio por el maestro de otras prácticas anteriores correspondientes a otros cursos.
4. Depositar la agarosa fundida de los pasos anteriores en la bandeja de la cubeta de electroforesis procurando que cubra el fondo uniformemente y no forme burbujas. Antes de que solidifique, introducir en el centro del gel el molde para los carriles.

5. Cuando el gel haya solidificado, extraer el molde para los carriles cuidadosamente.

2º) REALIZACIÓN DE LA ELECTROFORESIS

1. Una vez que tengamos los carriles del gel, cortar la parte inferior de pipetas Pasteur. Mantener pulsado la boquilla de la parte superior de ésta, hincar la pipeta en el pocillo del molde (situado bajo la cubeta desde el principio), soltar la boquilla de la pipeta y de esta manera, se realizarán los pocillos en el gel de agarosa, ya que los tapones de agarosa serán succionados por la pipeta Pasteur. 
   
   
   Nota: En caso de que algún tapón de agarosa quede adherido aún al gel, ayudarnos de una aguja.
   
2. Colocar la bandeja con el gel en la cubeta de electroforesis y disponer papel de filtro en cada uno de sus extremos de manera que sobresalga hacia el exterior. Dicho papel deberá estar empapado en el tampón.
   
   
   
   
3. Depositar el tampón en cada uno de los vasos de la cubeta de electroforesis hasta llenarlos y asegurarse de que el papel de filtro que sobresale de los extremos del gel de agarosa esté sumergido en el tampón. No cubrir el gel con el tampón.
   
4. Posteriormente, echar 20 microlitros de cada Ag (A,B y C) en los pocillos correspondientes (A en el superior, B en el central y C en el inferior). Cambiar las puntas de la pipeta entre Ag y Ag. 
   
   
   
   
   
   
   
   
5. Cerrar la tapa de la cubeta de electroforesis y conectar los electrodos respetando la polaridad y teniendo en cuenta que los Ag a identificar están cargados negativamente.
6. Conectar la cubeta a la fuente de alimentación y aplicar un voltaje de 125 V durante 35 minutos aproximadamente. Comprobar que hay burbujas saliendo de los electrodos. 
7. Una vez finalizada la electroforesis, desconectar la fuente de alimentación y quitar la tapa de la cubeta. Retirar el papel de filtro y extraer de la cubeta la bandeja con el gel. Depositarlo en una superficie horizontal para proceder a la fase de difusión de Ag y Ac.

3º) DIFUSIÓN DE LOS Ag Y Ac

1. Añadir 50 microlitros de cada Ac en el carril correspondiente procurando que se distribuya por todo el carril.
2. Colocar la bandeja con el gel en una cámara húmeda.
3. A los minutos de haber dispensado los Ac, podemos ver cómo difunden los Ag y Ac por el gel.
   
   
   
   

Nota: No hemos esperado a que transcurrieran las 24-48 horas debido a que hemos tenido el fallo de dispensar los Ac en los carriles antes de realizar la electroforesis (seguidamente de haber dispensado los Ag). El resultado sería más o menos parecido a la siguiente imagen (arcos de precipitación):