4ª PRÁCTICA

21/01/2020
PRÁCTICA Nº4: "RUBEOLA IgG ELISA"

COMPONENTES DEL KIT

• Microtiras de IgG recubiertas de Ag de Rubeola.
• Calibradores A-E. (Suero humano diluido con PBS) (0-10-50-200-500 UI/mL). Listos para usar.
  
• Conjugado de IgG anti-humano (15 mL). Son Ac IgG anti-humanos de conejo.
• Sustrato listo para usar.
• Solución de paradas lista para usar.
• Solución diluyente para la muestra: lista para usar.
• Solución de lavado (10 x de concentración): 1 parte de solución de lavado y 9 de agua destilada.
• Muestra: Suero o plasma (hay que diluirla con el diluyente y la dilución es 1:101).

MATERIAL NECESARIO

• Pipeta automática de 100-1000 microlitros y de 5 microlitros.
• Puntas amarillas y azules.
• Placa con Rubeeola.
• 3 gradillas.
• 1 tubo eppendorf.
• Papel Parafilm.
• Tubos Falcon de 50 mL.
• Papel de aluminio.
  
  
  
  

PROCEDIMIENTO
1º) PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS:

• Solución de lavado diluir antes de usar al 1/9 con agua destilada.
  Nota: Se han encargado de su preparación los alumnos de la primera mesa (60 mL de solución de lavado para toda la clase). Han realizado alícuotas para todos los compañeros de la clase en tubos Falcon.
  

2º) TÉCNICA:

1. Preparar un pocillo para el sustrato blanco (poner al principio).
2. Preparar 5 pocillos para los calibradores.
3. Preparar pocillo para la muestra.
   Nota: Necesitamos 7 pocillos en total.
   
4. Depositar en un tubo eppendorf 500 microlitros de "Rubeola IgG ELISA" y 5 microlitros de la muestra. 
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
5. Echar 100 microlitros diluidos 1:101 de la muestra en cada pocillo de calibradores.Dejar el primer pocillo vacío para el blanco del sustrato. Depositar el calibrador A en el 2º pocillo, el calibrador B en el tercer pocillo, calibrador C en el 4º pocillo, calibrador D en el 5º pocillo y calibrador E en el 6º pocillo. En el 7º pocillo, depositar 100 microlitros de la muestra diluida.
   Nota: Blanco (1º pocillo vacío), en los pocillos del 2º al 6º, disponer todos los calibradores y en el último (7º) la muestra.
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
6. Tapar la placa con papel Parafilm e incubar 60 minutos a temperatura ambiente.
   
7. Después de incubar, volcar el líquido de todos los pocillos invirtiendo la placa sobre papel absorbente. Lavar 3 veces los pocillos de la placa depositando 300 microlitros de solución de lavado en todos ellos menos en el 1º (Blanco). Después de cada lavado, invertir la placa sobre papel absorbente para desechar la solución de lavado.
   Notas: Evitar rebosar los pocillos. Lavar con puntas de pipeta distintas. Con papel absorbente, dejar reposar la tira boca abajo. La parte más importante de esta práctica es el lavado.
   
8. Pipetear 100 microlitros de conjugado anti IgG con excepción del blanco (primer pocillo).
   
   
   
   
   
   
   
9. Tapar los pocillos con papel Parafilm e incubar 30 minutos a temperatura ambiente.
   
10. Repetir los 3 lavados con 300 microlitros de solución de lavado.
    
    
    
    
11. Pipetear 100 microlitros de sustrato en todos los pocillos incluido el blanco.
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
12. Tapar los pocillos con papel de aluminio e incubar 20 minutos.
13. Pipetear 100 microlitros de solución de parada incluido el blanco.
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
14. Medir la Absorbancia (A) a 450 o 620 nm. El color es estable durante 60 minutos.

3º) MEDICIÓN MEDIANTE LECTOR DE MICROPLACAS:
- Efectuar con el blanco del pocillo A1 la calibración a 0 con el lector de ELISA.
- Medir la absorbancia de todos los pocillos a 450 nm.
- Anotar los resultados de los calibradores y la muestra.
- Si la calibración a 0 no es posible automáticamente, restar el valor del pocillo blanco al resto de los valores.

 

4º) CÁLCULO DEL VALOR DE LA MEDICIÓN:
Para obtener resultados cuantitativos en UI/mL se realiza una curva de calibración con las absorbancias en el eje Y y los calibradores en el eje X. Por extrapolación, podemos obtener la concentración de la muestra.
- La concentración de la muestra problema, ha salido 780'4 UI/mL.
- Calibrador A: 0 UI/mL - 0 Absorbancia.
- Calibrador B: 10 UI/mL - 0 Absorbancia.
- Calibrador C: 50 UI/mL - 0'008 A.
- Calibrador D: 200 UI/mL - 0'452 A.
- Calibrador E: 500 UI/mL - 1'924 A.
- Muestra problema: 780'4 UI/mL - 3'003 A.

OBSERVACIONES

• Hemos hecho 6 grupos (5 de 4 personas y 1 de 3 personas).
• Cumplir los tiempos de incubación.
• Utilizar puntas de pipeta distintas cada vez que cambiemos de pocillo.
• En los pocillos donde hemos realizado la práctica, ya viene la Rubeola aplicada sobre el fondo de cada uno.